HPLC法測定獨子藤中雷公藤紅素的含量
【摘要】 目的建立高效液相色譜法測定獨子藤中雷公藤紅素的含量，為雷公藤紅素的藥用植物資源開發提供依據。方法 采用Supelco Discovery C18柱(25 cm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-5%(體積分數)H3PO4水溶液(體積比80∶20)，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為426 nm。結果 雷公藤紅素在40~200 μg·mL-1范圍內與峰面積呈良好線性關系(r=0.999 1)。獨子藤中雷公藤紅素的平均質量分數為0.055 5%，雷公藤紅素的平均回收率為97.6%，RSD=1.78% (n=6)。結論 該方法簡便、準確、靈敏度高、重現性好，可用于獨子藤中雷公藤紅素的含量測定;獨子藤中雷公藤紅素含量較高，可作為雷公藤紅素的資源植物加以開發利用。
【關鍵詞】 獨子藤;雷公藤紅素;高效液相色譜法;成分分析
Abstract:ObjectiveTo determine the content of tripterine in Celastrus monospermus Roxb by HPLC for developing the medicinal resources of celastrol.Methods An external standard method by HPLC with Discovery C18 column (25 cm×4.6 mm,5 μm) was employed.The mobile phase was consisted of methanol-5%(φ) phosphoric acid solution (80︰20) (ξ)at the flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 426 nm.Results It showed good linearity in the range of 40-200 μg·mL-1 (r=0.999 1).The content of tripterine in Celastrus monospermus Roxb was 0.055 5%,and the average recovery rate of celastrol was 97.6%(RSD=1.78%,n=6).Conclusion The method is simple and accurate,sensitive and reproducible and can be used in the quality control of Celastrus monospermus Roxb.The content of tripterine in Celastrus monospermus Roxb was high,which can be exploided as the herbal resource.
Key words:Celastrus monospermus Roxb; tripterine; HPLC; assay
獨子藤(Celastrus monospermus Roxb.)為衛矛科南蛇藤屬植物，分布于我國福建、廣東、云南、貴州、廣西等省區及越南和印度等地，主要生長于海拔1 000 m以上的林帶中[1]。研究表明獨子藤的化學成分主要為生物堿和木栓烷型三類化合物，其中木栓烷型三類化學成分對風濕病、白血病和皮膚病均有較好療效[2]。雷公藤紅素為木栓烷型三類化合物，是雷公藤片、雷公藤多苷片等治療類風濕病制劑的有效成分之一,主要來源于中藥雷公藤的根皮，具有抗炎、免疫抑制及抗腫瘤等多種藥理活性[3]。中美科學家于2006年聯合發現雷公藤紅素的抗癌新機制[4]，引發了雷公藤紅素抗癌活性研究的熱潮。我們在獨子藤的化學成分研究中發現該植物根中富含雷公藤紅素，是一種潛在的雷公藤紅素植物資源,具有重要開發價值。但至今尚未見有關獨子藤中雷公藤紅素含量測定的文獻報道。本文建立了獨子藤中雷公藤紅素的含量測定方法，對合理開發獨子藤植物資源、促進雷公藤紅素的深入研究,均具有重要意義。
1儀器與試藥
1.1儀器
Shimadzu LC-10AT型高效液相色譜儀(日本島津公司)，SPD-10AT型紫外-可見檢測器(日本島津公司)，HW-2000色譜工作站;Millipore溶液過濾器;Millipore 0.45 μm濾膜;AY120電子分析天平(Shimadzu公司);RE-52A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。
1.2試藥
雷公藤紅素對照品(自制，經HPLC法測定純度≥98%);獨子藤于2008年10月采自廣東省陽春市，由廣東藥學院李書淵教授鑒定為獨子藤Celastrus monospermus Roxb.;硅膠(柱層析硅膠，青島海洋化工有限公司);甲醇為色譜純;水為超純水;其余試劑均為分析純。
2方法與結果
2.1色譜條件
色譜柱：Supelco Discovery C18柱(25 cm×4.6 mm，5 μm);流動相：甲醇-體積分數5%H3PO4水溶液(體積比80∶20);流速：1.0 mL·min-1;檢測波長：426 nm;柱溫：25 ℃;進樣量：20 μL。色譜圖見圖1。
2.2對照品貯備液的制備
精密稱取雷公藤紅素對照品5.0 mg，置25 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解并定容，搖勻，得到質量濃度為0.20 mg·mL-1的雷公藤紅素對照品貯備液。
2.3供試品溶液的制備
取獨子藤藥材適量，粉碎過40目篩，精密稱取10.0 g，裝入100 mL帶塞三角瓶中，加入三氯甲烷超聲提取3次，每次50 mL，每次30 min。靜置，濾取上清液，旋轉蒸發儀上濃縮至干。稱取4.0 g硅膠裝柱(1.5 cm×10 cm)，以三氯甲烷1 mL超聲溶解樣品，上樣。先以三氯甲烷50 mL進行洗脫，棄去洗脫液，再用三氯甲烷-甲醇(體積比95∶5)100 mL洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，旋轉蒸發儀上濃縮至干。殘渣用甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，0?45 μm微孔濾膜濾過。平行操作5份，作為1~5號供試品溶液。[PSd041;S*2〗A.對照品; B.供試品圖1雷公藤紅素的HPLC色譜圖Figure 1HPLC chromatograms of reference
2.4線性關系的考察
分別精密吸取“2.2”項下對照品貯備液1、2、3、4、5 mL置于5 mL容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容，搖勻，制得系列對照品溶液。依次取上述溶液各20 μL進樣，依法測定。以雷公藤紅素的峰面積積分值(A)為縱坐標，質量濃度(ρ)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A=5.5886×103ρ-2.0127×104(r=0.999 1)。結果表明，雷公藤紅素在40~200 μg·mL-1范圍內與峰面積呈良好線性關系。
2.5精密度試驗
精密吸取同一雷公藤紅素對照品溶液20 μL，連續進樣6次，測得雷公藤紅素的峰面積RSD為1?96%，結果表明儀器精密度良好。
2.6穩定性試驗
取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，依法測定，結果雷公藤紅素峰面積的RSD為2?98%，表明供試品溶液在12 h內穩定。
2.7重復性試驗
取同一批次的獨子藤藥材，稱取5份，按“2.3”項下方法處理并進樣測定，結果雷公藤紅素峰面積的RSD為2.59%，表明本方法重復性良好。
2.8加樣回收率試驗
取獨子藤藥材6份，各5 g，精密稱定，分別按低、中、高不同質量精密加入雷公藤紅素對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算回收率，結果見表1。表1加樣回收率試驗
2.9樣品測定
分別精密吸取“2.3”項下1~5號供試品溶液20 μL，注入色譜儀，依法測定。每份測3次，計算，結果其雷公藤紅素的質量分數分別為0.054 7%、0?056 2%、0.055 3%、0.054 0%、0.057 2%，平均值為0.055 5%，RSD為2.26%。
3討論
3.1本研究對不同樣品前處理方法效果進行了考察，比較了三氯甲烷超聲提取后直接進樣與三氯甲烷超聲提取后經硅膠柱層析純化再進樣的色譜圖。結果顯示，前者雜質峰數目較多，對色譜柱的污染較大;而后者能有效去除其他極性雜質，雷公藤紅素色譜峰與其他峰分離良好，測定無干擾。
3.2本研究在參照文獻[5-7]的基礎上，考察了不同流動相的分離效果。結果表明流動相為甲醇-體積分數5%H3PO4水溶液(體積比80∶20)時，雷公藤紅素的峰形對稱且能與其他成分良好分離，同時亦有利于獨子藤中其他成分的含量測定。
3.3本文方法測得獨子藤中雷公藤紅素的平均質量分數為0.055 5%，相對較高，提示可將獨子藤作為雷公藤紅素的藥用植物資源加以開發利用，具有重要意義。且雷公藤紅素的毒性很大，建立并完善雷公藤紅素的含量測定方法，亦有助于安全合理地利用獨子藤藥材。
【參考文獻】
[1] 中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒：第二冊[M].北京:科學出版社,1980:661.
[2] 劉錫葵,吳大剛.獨籽藤中木栓烷三化學成分[J].中草藥,1993,24(8):395-397.
[3] 夏玲紅,崔嵐.雷公藤紅素的藥理作用研究進展[J].醫藥導報,2009,26(6):730-732.
[4] YANG Huan-jie,CHEN Di,Cui Qiu-zhi, et al.Celastrol,a triterpene extracted from the Chinese “Thunder of God Vine,” is a potent proteasome inhibitor and suppresses hhuman prostate cancer growth in nude mice[J].Cancer Res,2006,66(9):4758-4765.
[5] 馮玉靜,王定勇,陳銘祥.南蛇藤中扁蒴藤素提取分離工藝研究[J].廣東藥學院學報，2009,25(2):137-140.
[6] 庫爾班江,賽德艾合買提,張焱.雷公藤制劑中雷公藤紅素的高效液相色譜法測定[J].新疆師范大學學報:自然科學版,2008,27(4):42-45.
[7] 庫爾班江,張焱.雷公藤藥材中雷公藤紅素的高效液相色譜法測定[J].西北藥學雜志,2008,23(2):82-84.
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