金納多對RCS鼠視網膜色素變性神經元保護作用
【摘要】 目的 探討金納多(Ginaton，EGb761)對RCS大鼠視網膜色素變性神經元保護作用的機制。方法將出生后雄性RCS大鼠48只隨機分為給藥組和對照組。給藥組大鼠從生后7 d開始腹腔注射金納多，每3 d注射一次，劑量為100 mg/kg。對照組大鼠注射生理鹽水，劑量相同。蘇木精伊紅染色和TUNEL檢測觀察EGb761對視網膜色素變性神經元的保護作用。應用免疫組織化學方法檢測Caspase2蛋白的表達。結果 給藥組大鼠生后20和25 d，感光細胞的數目與對照組大鼠比較明顯增加(t=3.32、3.56,P<0.05)。給藥組大鼠生后25 d TUNEL檢測陽性細胞數目比對照組少，差異有統計學意義(t=3.74,P<0.05)。生后25～40 d，給藥組和對照組大鼠在節細胞層和內核層觀察到Caspase2陽性染色。給藥組大鼠生后20和25 d時內核層Caspase2陽性細胞數少于對照組(t=2.87,P<0.05)。結論 在RCS大鼠視網膜變性的早期，EGb761對神經元起保護作用，其作用機制可能與Caspase2蛋白的低表達有關。
【關鍵詞】 視網膜炎 色素性 金納多 細胞凋亡 Caspase2蛋白 大鼠
[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the protective mechanisms of Ginaton (EGb761) on hereditary retinal dystrophy in RCS rats.MethodsA total of 48 male RCS rats were randomly divided into treated and control groups. EGb761 100 mg/kg was injected intraperitoneally, once every three days in treated group， starting from seven days after birth; saline was given to the controls, dose and medication being the same as the treated group. The protective effect of EGb761 against retinal dystrophy was assessed by HE staining and TUNEL. The expression of Caspase2 was detected by immunohistochemistry. ResultsThe number of photoreceptor in the treated group was more than that in the controls at 20 and 25 days after birth (t=3.32,3.56;P<0.05). Twentyfive days after birth, the number of TUNELpositive cells of the treated group was obviously less than that of the controls (t=3.74,P<0.05). From 25 to 40 days after birth, the Caspase2positive cells were seen in the ganglion cell layer and inner nuclear layer in both treated and control groups. The number of positive cells in the inner nuclear layer of treated group was less than that of the control group (t=2.87,P<0.05). ConclusionEGb761 has a protective effect on the early stage of retinal degeneration of RCS rats, its mechanisms may be related to the low expression of Caspase2.
[KEY WORDS]retinitis pigmentosa; EGb761; apoptosis; Caspase2 protein; rats
視網膜色素變性是一種眼科十分常見的致盲性疾病，到目前為止，其發病機制尚不清楚，亦無有效的防治辦法。1938年，BOURNE等[1]首次報道了自發性蛻變的鼠種——RCS(Royal College of Surgeons)大鼠，人們基于這一動物模型進行了大量研究。RCS大鼠主要表現為視網膜色素上皮(RPE)不能有效吞噬感光細胞外節脫落的膜盤，致使膜盤堆積，感光細胞變性[2]。隨著凋亡概念的提出，1994年TSO等[2]認為RCS大鼠感光細胞變性是通過凋亡的途徑實現的。金納多(Ginaton，EGb761)是從銀杏葉中提取的復合物，可以增加腦血管的血流量，保護腦細胞，清除有害的氧化自由基，并有顯著的抗凋亡作用[3]。本實驗從感光細胞開始凋亡時觀察EGb761對神經元的保護作用，并探討EGb761的作用機制，為臨床上日益增多的視網膜色素變性疾病的治療提供實驗和理論依據。
1 材料與方法
1.1 組織來源
出生后雄性RCS大鼠48只，隨機分為給藥組和對照組。12 h光照12 h黑暗循環條件下飼養，自由飲食、飲水。給藥組大鼠從生后7 d開始腹腔注射EGb761，每3 d注射一次，劑量為100 mg/kg。對照組大鼠從生后7 d開始腹腔注射同劑量生理鹽 水。兩組大鼠分別在生后15、20、25、30、35、40 d處死，取其視網膜組織，觀察EGb761對感光細胞的保護作用。
1.2 標本制作
水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉動物后，取出眼球，沖洗后立即放入40 g/L多聚甲醛中固定6 h，去眼前節及玻璃體，依次放入100 g/L蔗糖中2 h，200 g/L蔗糖中2 h，300 g/L蔗糖中過夜。用OCT包埋劑填滿眼球,沿眼球矢狀面作連續冷凍切片，厚度5 μm，依次行蘇木精伊紅、TUNEL、Caspase2染色。
1.3 檢測方法
原位細胞凋亡檢測和Caspase2免疫組化檢測均按常規操作。原位細胞凋亡檢測陰性對照切片不加末端核糖核酸轉移酶，陽性對照切片在反應前先用DNA酶Ⅰ消化。Caspase2免疫組化檢測陰性對照切片不加一抗。
1.4 結果判定
采用激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS,IX81)獲得數值顯微圖像。用8比特1 024×1 024像素的20倍放大的顯微圖像。TUNEL陽性表達為細胞核呈綠色熒光，測量視網膜每100 μm長視野內陽性細胞數。Caspase2陽性表達為細胞膜或胞漿呈黃色或棕黃色染色。每張切片取4個視野，用光學顯微鏡在200倍視野下觀察，計數每 100 μm長視野內陽性細胞數。
2 結 果
2.1 蘇木精伊紅染色
2.1.1 對照組 大鼠生后15 d視網膜還未發育成熟。20 d時，視桿層厚度增加，內節變窄，外節增厚，有排列紊亂及空泡現象。25 d時，感光細胞數目有所下降。30 d時，感光細胞染色加深，其數目減少，外節形態不規則，內節明顯變窄。35 d時感光細胞數目與30 d相比明顯減少。40 d時，感光細胞數目與35 d相比明顯減少，視網膜色素上皮細胞可見排列紊亂，體積增大，外形不規則。60 d時，僅有少許感光細胞存在，平均細胞計數為(9.80±2.59)個。內核層(INL)細胞、神經節細胞形態和數目基本正常。
2.1.2 給藥組 大鼠生后15 d，外核層(ONL)感光細胞數目與對照組大鼠相比無明顯差別(t=1.36，P>0.05)。20 d時，感光細胞數目比對照組細胞數目多(t=3.32,P<0.05)。25 d時，給藥組大鼠感光細胞數目較20 d時有所下降，但與對照組相比明顯增加(t=3.56,P<0.05)。見表1。
2.2 TUNEL檢測
對照組大鼠生后25 d，ONL可以觀察到少許TUNEL反應陽性的細胞核。30 d時，TUNEL反應陽性細胞核數目明顯增加。35 d時陽性細胞核數目最多。40 d時，陽性細胞核數目較35 d時減少。給藥組大鼠生后25 d，ONL也可以觀察到TUNEL反應陽性的細胞核，陽性細胞計數與對照組相比，差異有統計學意義(t=3.74,P<0.05)。其余時間段無明顯差異。見表2。
2.3 Caspase2檢測
生后20～40 d，給藥組和對照組大鼠在節細胞層和INL觀察到Caspase2陽性染色。給藥組大鼠在20 d和25 d時INL的Caspase2陽性細胞數多于對照組(t=2.87,P<0.05)，其余各時間段差異無顯著性。給藥組、對照組大鼠INL的 Caspase2染色陽性細胞均在生后35 d達到高峰。見表3。表1 兩組不同日齡大鼠視網膜每30 μm長視野內ONL感光細胞數目的變化表2 兩組不同日齡大鼠視網膜每100 μm長視野內TUNEL檢測陽性細胞數表3 兩組不同日齡大鼠視網膜每100 μm長視野內INL的Caspase2陽性細胞數 3 討 論
EGb761俗稱銀杏黃酮，主要含黃酮甙、內酯、白果內酯。自從被發現以來臨床上廣泛用于治療腦部、外周等血液循環障礙。然而近年來許多研究表明,EGb761在缺血、低氧以及非自然原因凋亡所致損傷的保護作用中發揮著重要作用。有研究證實,EGb761對羥自由基誘導的大鼠腦神經細胞的 凋亡有抑制作用[4]。BEHARCOHEN等[5]的實驗證實了NO參與了亞硝酸鹽細胞毒性對培養的牛視網膜色素上皮細胞的作用，EGb761作為一種自由基清除劑可保護視網膜色素上皮細胞免受亞硝酸鹽細胞毒性的損傷。EGb761還可以延緩白內障動物模型中眼球混濁的進程，可能有抗白內障的有益作用。FIES等[6]發現EGb761對老年黃斑變性導致的視力受損有治療作用。這些均為EGb761對遺傳性視網膜色素變性可能的治療作用提供了依據。
自從首次報道RCS大鼠以來，人們對這一動物模型視網膜色素變性導致感光細胞凋亡的機制進行了大量研究。劉斌等[7]報道，RCS大鼠出生后25 d時，視網膜PRC內節處偶見有P53陽性染色，30 d時PRC胞質內有明顯的陽性染色顆粒，主要位于內節，外節處為陰性，少許PRC細胞核呈陽性染色。RCS大鼠出生后30 d P53蛋白呈強陽性，提示PRC的凋亡可能為P53依賴性。遲煥芳等[8]研究顯示,RCS大鼠視網膜變性過程中bcl2原癌基因可能不參與感光細胞的保護機制。目前對視網膜色素變性的治療方法主要有基因治療、感光細胞移植、藥物干預。前兩種方法因目前尚難解決的一些技術問題使其應用受到很大限制，而藥物干預則通過影響視網膜色素變性形成過程中一些代謝變化而顯示了良好的應用前景。本實驗中我們觀察到,給藥組大鼠在生后20、25 d外核層感光細胞的數目比對照組多(P<0.05)，提示EGb761在RCS大鼠感光細胞變性的早期對感光細胞有保護作用。但研究結果還表明，RCS大鼠出生25 d以后，給藥組和對照組視網膜感光細胞存留數目的差別無顯著性，這可能是由于RCS大鼠生后25 d感光細胞發生凋亡，35 d是感光細胞凋亡的高峰期。TUNEL檢測表明，給藥組大鼠視網膜在25 d時凋亡的細胞數比對照組減少(P<0.05)，余時間段兩者差異無顯著意義。本實驗結果提示，EGb761對感光細胞早期凋亡有抑制作用。
Caspase即半胱氨酸天冬氨酸酶，通常以無活性的蛋白酶原形式在細胞內合成和分泌。在放射線、氧化損傷、缺血低氧等誘導凋亡信號的刺激下，酶原形成四聚體而活化，形成Caspase活化級聯反應。Caspase一經激活裂解其作用底物，細胞凋亡便不可逆地進入實施階段，并以細胞解體、凋亡小體形成而告終。Caspases2檢測顯示,生后25～40 d，給藥組和對照組大鼠在節細胞層和INL觀察到Caspase2陽性染色。給藥組在20、25 d時INL的Caspase2陽性細胞數少于對照組(P<0.05)。給藥組和對照組INL Caspase2陽性細胞數均在35 d達到高峰，其趨勢與TUNEL檢測相一致。結果提示，EGb761對凋亡抑制作用可能與抑制Caspase2蛋白的表達有關。
視網膜色素變性是一種發病年齡早、病程進展慢、對視力影響大的遺傳性致盲眼病。多種突變基因干擾了感光細胞內光電轉化反應和能量代謝，并通過不同途徑，激活視網膜色素上皮細胞及感光細胞內程序化死亡過程。但迄今為止，視網膜色素變性一直沒有有效的藥物治療。本實驗在RCS大鼠不同鼠齡段注射EGb761，通過TUNEL及凋亡相關因子檢測，結果顯示EGb761能抑制感光細胞早期神經元的凋亡。EGb761對神經元具有保護作用，臨床應用較為安全，因此，將來或許可以把EGb761作為視網膜色素變性的治療藥物之一。
【參考文獻】
[1]BOURNE M C, CAMPBELL D A, TANSLEY K. Hereditary degeneration of rat retina[J]. Ophthalmol, 1938, 22: 613623.
[2] TSO M O, ZHANG C, ABLER A S, et al. Apoptosis leads to photoreceptor degeneration in inherited retinal dystrophy of RCS rats[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994,35(6):26932699.
[3] SMITH J V, BURDICK A J, GOLIK P, et al. Antiapoptotic properties of Ginkgo biloba extract EGb761 in differentiated PC12 cells[J]. Cell Mol Biol (Noisylegrand), 2002, 48(6):699707.
[4] NI Y, ZHAO B. Preventive effect of Ginkgo biloba extract on apoptosis in rat cerebellar neuronal cells induced by hydroxyl radicals[J]. Neurosci Lett, 1996,214(2/3):115118.
[5] BEHARCOHEN F F, HEYDOLPH S. Peroxynitrite cytotoxicity on bovine retinal pigmented epithelial cells in culture[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1996,226(3):842849.
[6] FIES P, DIENEL A. Ginkgo extract in impaired vision——treatment with special extract EGb761 of impaired vision due to dry senile macular degeneration [J]. Wien Med Wochenschr, 2002,152(15/16):423426.
[7] 劉斌,朱秀安. 遺傳性視網膜變性感光細胞凋亡與P53蛋白表達[J]. 北京醫科大學學報, 1998,30(2):110112.
[8] 遲煥芳,喬淑紅,曹文強. RCS大鼠感光細胞凋亡與Bcl2蛋白表達[J]. 青島大學醫學院學報, 2003,39:123126.
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