高效液相色譜法測定人血漿中全反式維甲酸血藥濃度
【關鍵詞】 血藥濃度
摘要:目的 建立高效液相色譜法測定人血漿中全反式維甲酸濃度。方法 色譜柱為Supelcosil LC18DB柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);流動相為甲醇水冰乙酸(體積比82∶17∶1);柱溫為室溫;流速1.5 mL・min-1;檢測波長為340 nm。結果 全反式維甲酸血藥質量濃度在10～1000 ng・mL-1范圍內，與峰面積比有良好的線性關系(r=0.9997)，最低檢測濃度為2.5 ng・mL-1。平均方法回收率為(94.5±4.7)%(n=15)。日內RSD≤4.1%，日間RSD≤6.2%。結論 本方法簡單、快速、靈敏、重現性好，適用于全反式維甲酸臨床血藥濃度監測及人體藥代動力學研究。
關鍵詞:全反式維甲酸;血藥濃度;高效液相色譜法
Abstract: Objective To establish a HPLC method for determination of alltrans retinoic acid in human plasma. Methods A Supelcosil LC18DB column (5 μm,4.6 mm×250 mm) was adopted. Mobile phase was a mixture of methanol,water and glacial acetic acid(82∶17∶1). The flow rate was 1.5 mL・min-1. The UV detection wave was 340 nm. ResultsThe assay procedure was shown to produce linear calibration curves over the range of 10 ng・mL-1 to 1000 ng・mL-1 of alltrans retinoic acid in plasma (r=0.9997). Within the range,the recovery rate was (94.5±4.7)%,and the intraday RSD and interday was less than 4.1% and 6.2%,respectively. The detection limit of all trans retinoic acid was 2.5 ng・mL-1. Conclusions This method is repeatable,convenient and sensitive for plasma concentration monitoring and clinical pharmacokinetics study of alltrans retinoic acid.
Key words:alltrans retinoic acid; plasma concentration; HPLC
全反式維甲酸(alltrans retinoic acid,ATRA) 是維生素A 的天然氧化代謝產物，可抑制白血病細胞的增殖，誘導白血病細胞分化成熟，是目前治療急性早幼粒細胞白血病(APL)的有效藥物。ATRA對APL初發患者完全緩解率可達85%以上，但對復發患者再次應用ATRA則效果不佳，其原因可能是ATRA對參與其代謝的酶活性具有自身誘導作用，持續用藥導致血藥濃度逐步降低[1]。本文參考文獻[2-4]，建立了一種靈敏、準確的ATRA血藥濃度HPLC測定法，旨在為全反式維甲酸臨床血藥濃度監測及人體藥代動力學研究提供測定方法。
1 材料與方法
1.1 儀器
Waters高效液相色譜儀(515型恒流泵，486型紫外檢測器，Millennium32色譜工作站);XW―80A旋渦混合器(上海醫科大學儀器廠);3K18高速冷凍離心機(Sigma);高速離心機(美國雅培公司TDx儀附件)。
1.2 藥品與試劑
ATRA對照品(Sigma,純度：98%)，阿維A酸(內標，羅氏公司)，甲醇為色譜純試劑，其余試劑均為分析純。
1.3 色譜條件
色譜柱為Supelcosil LC18DB柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);柱溫為室溫。流動相：甲醇水冰乙酸(體積比82∶17∶1);流速1.5 mL・min-1。檢測波長340 nm。
1.4 血藥濃度測定法
1.4.1 ATRA對照溶液配制
精密稱取ATRA對照品適量，以甲醇溶解并定容，制得濃度為100 μg・mL-1的ATRA儲備液。將ATRA儲備液以甲醇稀釋，配制濃度分別為0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg・mL-1的ATRA對照溶液。
1.4.2 內標液配制
取內標阿維A酸適量，置于100 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，制得濃度為7.5 μg・mL-1的內標液。
1.4.3 樣本處理
精密吸取血漿樣品1 mL，置10 mL具塞離心試管中，加入內標溶液20 μL，旋渦混合30 s。加入1 mol・L-1的HCl溶液500 μL，漩渦混合30 s，再加入乙酸乙酯3 mL，旋渦混合1 min，4 500 r/min離心5 min。轉移上層液至尖底試管中，于37 ℃水浴中氮氣流吹干。殘渣加入流動相200 μL漩渦混合30 s使溶解，10 000 r/min離心5 min，取上清液50 μL進樣，記錄色譜圖，以ATRA峰面積(As)與內標峰面積(Ai)之比代入標準曲線計算ATRA血藥濃度。
1.4.4 標準曲線
精密量取空白血漿1 mL，置10 mL具塞離心管中，分別加入不同濃度ATRA對照溶液20 μL，混勻，使血藥濃度分別為10、20、50、100、200、500、1000 ng・mL-1。按樣本處理方法操作，以不同濃度ATRA系列溶液的As和Ai來計算A(A=As/Ai)，以A值為縱坐標，ATRA質量濃度(ρ)為橫坐標進行直線回歸。
1.4.5 回收率及精密度
分別于1 mL空白血漿中加入低、中、高3種濃度的ATRA對照溶液20μL，混勻，使其濃度分別為10、200、1000 ng・mL-1，按樣本處理方法操作，計算ATRA血藥濃度，以測得濃度與配制濃度之比計算方法回收率。另以甲醇配制相應系列濃度的ATRA溶液，不經提取直接測定，以此為標準，將兩組峰面積相比，計算ATRA萃取回收率。以1 d內測得的ATRA濃度計算日內精密度，以1周內5次測定的ATRA濃度計算日間精密度。
2 結 果
2.1 色譜行為
在上述色譜條件下，ATRA與內標物及血漿內源性物質能夠較好分離，ATRA與內標的保留時間分別為8.8 min和6.7 min。空白血漿及血漿樣品色譜圖見圖1。
2.2 線性范圍
ATRA血藥質量濃度(ρ)在10～1000 ng・mL-1范圍內，與峰面積比(A)有良好線性關系，其回歸方程為：A=00116ρ+0.0036，r=0.9997。以信噪比S/N=3：1計，ATRA最低檢測濃度為2.5 ng・mL-1。
2.3 回收率及精密度
高、中、低3種濃度的提取回收率分別為(84.6±5.2)%、(81.2±6.3)%、(81.6±4.6)%，平均方法回收率為(94.5±4.7)%(n=15)。3種濃度的日內RSD≤4.1%，日間RSD≤6.2%。結果見表1。表1 回收率及精密度(略)
3 討 論
本文建立了一種靈敏、準確的ATRA血藥濃度高效液相色譜測定法，適用于APL病人ATRA 血藥濃度的常規監測及臨床藥代動力學研究。通過監測ATRA血藥濃度，可以更好地了解在某些APL病人連續用藥治療中臨床復發及耐藥的原因。
ATRA化學性質活潑，見光易異構化或氧化降解，因此在樣品提取過程中應特別注意避光操作。提取過程中血漿加入1 mol・L-1 HCl溶液，使血漿酸化，可提高萃取回收率，乙酸乙酯一步萃取可使萃取回收率達到80%以上。
由于ATRA中的羧基可以與色譜柱中的硅醇基等發生相互作用，導致色譜峰拖尾，在流動相中加入1%(ω)醋酸，可抑制這種作用，消除ATRA峰拖尾現象。
參考文獻:
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