青島地區結核分支桿菌吡嗪酰胺耐藥基因pncA的檢測

時間：2024-09-21 15:52:32 藥學畢業論文

　　【摘要】目的了解青島地區結核分支桿菌耐吡嗪酰胺(PZA)分離株pncA基因突變的情況，探討其與耐PZA之間的關系。方法應用BACTEC460培養系統對76例結核分支桿菌臨床分離株進行結核分支桿菌常規培養和藥敏檢測，聚合酶鏈反應單鏈構象多態性(PCRSSCP)技術檢測pncA基因的突變。結果 76株結核分支桿菌臨床分離株均經PCR擴增出結核分支桿菌復合群保守序列IS6110基因片段，69株擴增出pncA基因的特異序列。后者包括：SSCP泳動異常者18株，其中耐藥株13株，敏感株5株;SSCP泳動正常者51株，其中耐藥株14株，敏感株37株。結論青島地區結核分支桿菌臨床分離株耐PZA主要分子機制之一為pncA基因的突變;PCRSSCP技術能快速準確地檢測結核分支桿菌耐PZA基因pncA 的突變，可彌補常規藥敏試驗的不足。

　　【關鍵詞】分支桿菌結核基因 pncA BACTEC培養方法聚合酶鏈反應單鏈構象多態性

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the mutations of pncA gene in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis and the relationship between pncA gene and pyrazinamide (PZA)resistance in Qingdao area. MethodsFrom 76 clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis, the routine culture and drug susceptibility detection were done by BACTEC460 system, and the mutations of pncA gene detected by PCRSSCP.ResultsAmong the 76 isolates, 44 strains were PZAsensitive and 32 PZAresistant by　the BACTEC460 system. With PCRSSCP, 18 strains displayed abnormal pncA SSCP profile, in which, 13 were PZAeresistant and five PZAsensitive. Fiftyone strains displayed normal pncA SSCP profile, in which 14 were PZAresistant and 37 PZAsensitive. ConclusionMutation of pncA gene might be one of the major molecular mechanisms in pyrazinamideresistance of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. PCRSSCP appears to be a promising method for rapid detection of pyrazinamideresistant Mycobacterium tuberculosis, preferable to the routine drugsusceptibility test.

　　[KEY WORDS]Mycobacterium tuberculosis; genes, pncA; BACTEC; polymerase chain reaction; singlestrand conformation polymorphism

　　近年來,結核病疫情呈現全球性明顯回升趨勢，其主要原因之一是耐藥菌株的產生和播散，尤其是耐多藥菌株的涌現。目前對結核分支桿菌耐藥分子機制的研究主要集中在各種藥物的作用靶位及其相關基因的突變位點上。吡嗪酰胺(PZA)自1949年首次用于肺結核治療以來，作為第一線抗結核藥物應用已有50多年的歷史。近幾年結核分支桿菌臨床分離株對其耐藥趨勢日漸上升，并且呈現與異煙肼和利福平同時耐藥的現象[1]。然而，目前對PZA的作用機制及耐藥分子機制尚不清楚。本文應用BACTEC460培養系統進行結核分支桿菌常規培養和藥敏檢測，聚合酶鏈反應單鏈構象多態性技術(PCRSSCP)檢測結核分支桿菌pncA基因，旨在了解青島地區結核分支桿菌耐PZA分離株的pncA基因突變情況，探討其與耐PZA之間的關系,以建立新的、快速有效的結核分支桿菌藥敏試驗方法，彌補常規藥敏試驗的不足。

　　1 材料和方法

　　1.1 標本來源

　　76例結核分支桿菌臨床分離株來自青島市結核肺病防治研究所2002年1～12月診治的肺結核病人。其中初治病人60例，復治病人16例;男43例，女33例;年齡21～83歲，平均52歲。

　　1.2 主要試劑與儀器

　　結核分支桿菌標準株(H37Rv)購自中國藥品生物制品檢定所，BACTEC460培養系統試劑購自BECTONDICKINSON公司，dNTP、 TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、PCR Marker均購自Promega公司，PCR擴增儀為PE公司480型。

　　1.3 痰標本的處理及PZA藥敏試驗

　　根據文獻[2]的方法進行菌種鑒定和藥敏試驗。痰標本經消化、離心，接種至含有C14棕櫚酸的12B培養基，37 ℃培養。第1周上機檢測生長指數(GI)值2～3次，以后每周測定1次，至第6周。結果判定標準如下：GI值0～10，培養陰性;GI值11～50，培養陽性;GI值51～100，可進行結核分支桿菌復合群與非結核分支桿菌鑒定;GI值500～800，可進行藥物敏感性試驗。

　　結核分支桿菌陽性標本一部分提取DNA，-20 ℃保存備用;另一部分在12B培養基內加入定量PZA進行藥敏試驗，同時以蒸餾水代替PZA作為對照。按以下標準判定結果：對照組的生長指數(AGI) 值>測試組的生長指數(△GI)值為敏感;AGI值<△GI值為耐藥;AGI值=△GI值為臨界。

　　1.4 PCR檢測結核分支桿菌IS6110及pncA基因

　　1.4.1 PCR引物的設計與合成根據Gene Bank中結核分支桿菌標準株H37Rv全基因序列,利用DNAStar軟件分別設計對應于結核分支桿菌復合群保守序列IS6110及pncA基因序列的 PCR引物。其中引物INS1和INS2擴增IS6110基因，引物pncA1和pncA2擴增pncA基因。引物序列及擴增片段長度見表1。引物由上海生工生物公司合成(PAGE純化)，純水稀釋分裝，保存于-20 ℃備用。

　　1.4.2 目的基因的PCR擴增取經BACTEC460培養系統培養陽性的增菌液1.5 mL于無菌干燥玻璃試管中，酚氯仿法提取DNA。以提取的DNA為模板進行PCR擴增，其循環條件為：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個循環;72 ℃延伸10 min。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。表1 引物序列及其產物

　　1.5 PCRSSCP分析

　　pncA的PCR擴增產物變性后經80 g/L非變性聚丙酰胺凝膠電泳，銀染顯色后可見野生型的單鏈DNA與H37Rv標準對照的單鏈DNA位于同一位置，而突變型的單鏈DNA低于或高于H37Rv標準對照的單鏈DNA水平，以此來確定突變例數。

　　2 結果

　　2.1 BACTEC460培養系統檢測

　　從130份臨床痰標本中共檢出76株結核分支桿菌，陽性率為58.5%。其中對PZA敏感44株，耐藥32株，耐藥率為42.1%。

　　2.2 PCR擴增

　　本文76株結核分支桿菌臨床分離株均擴增出IS6110基因(245 bp)的目的條帶，與H37Rv標準株一致，表明這些臨床分離株均為結核分支桿菌。69株擴增出pncA基因的特異序列(254 bp)。7株未檢出pncA基因擴增產物，其中耐藥5株，敏感2株(圖1)。

　　2.3 PCRSSCP檢測結核分支桿菌pncA基因突變的結果

　　以結核分支桿菌標準株H37Rv為對照，69株結核分支桿菌臨床分離株中，SSCP泳動異常者18株，其中耐藥13株，敏感5株;泳動正常者51株，其中耐藥14株，敏感37株(圖2)。

　　2.4 PCRSSCP與BACTEC460培養系統藥敏試驗結果比較

　　BACTEC460培養系統藥敏試驗結果顯示，低度耐藥有8株SSCP泳動異常，13株SSCP泳動正常;高度耐藥有5株SSCP泳動異常，1株 SSCP泳動正常。PZA耐藥株pncA基因突變率為48.1%(13/27)，PZA敏感株pncA基因突變率為11.9%(5/42)。 BACTEC460培養系統PZA藥敏結果與PCRSSCP基因突變分析結果比較，差異無顯著性(χ2=3.37,P>0.05)。見表2。表 2 BACTEC460 PZA藥敏結果與PCRSSCP分析結果的比較

　　3 討論

　　目前我國結核分支桿菌的實驗室診斷主要依靠涂片染色鏡檢和結核桿菌的培養與鑒定。

　　痰標本涂片染色鏡檢法簡單、快速，是臨床常規開展的方法，但敏感性較低，只能作為篩選。傳統的藥敏方法依靠直接或間接的含藥培養基進行結核分支桿菌的藥敏鑒定，僅能反映體外耐藥性的程度。由于各個實驗室所用培養基不同，檢測方法不同，結果判定標準不一，導致報道結果差異。而且由于結核分支桿菌生長緩慢，需較長時間方能獲得結果，耗時太長，因而不能滿足臨床需要[3]。

　　BACTEC460培養系統是利用分支桿菌能夠分解C14棕櫚酸，產生14CO2的原理，自動檢測培養液中14CO2含量，并換算成GI值，由GI值的高低來判斷是否有細菌的生長。此種方法不僅提高了檢出率和分離速度，而且大大縮短了實驗周期。本實驗結果陽性率為58.5%。但由于此方法仍建立在細菌培養基礎上，結果回報日期仍較長，加之儀器價格昂貴，又具有放射性污染，在一定程度上限制了其廣泛應用，也不能滿足現代短程化療需要。由于PZA藥敏試驗需在酸性條件下(pH 5.0～5.5)進行，常用的改良羅氏培養基不能用于PZA藥敏試驗;BACTEC460培養系統檢測PZA藥敏試驗也需用特殊的酸性液體培養基，費用較高，長期以來國內開展PZA藥敏常規試驗的單位很少，也缺乏統一的方法和判定標準。

　　目前，結核分支桿菌的耐藥機制及耐藥的分子基礎大部分已被闡明，建立了多種快速檢測結核分支桿菌耐藥基因型的分子生物學診斷技術。PCRSSCP操作簡單、快速，2 d內即可獲得測定結果，不需特殊儀器設備和試劑，無放射性污染，無需限制性內切酶，可直接對PCR擴增產物進行多態分析確認單鏈突變位點，并且檢出率相對較高，已成為目前應用最廣泛的突變檢測技術之一。

　　結核分支桿菌對PZA耐藥性的產生，大量資料主要集中于對PZA酶的編碼基因pncA的研究。目前認為pncA基因突變，使PZA酶活性降低或消失，不能將PZA轉變為活性型，從而導致結核分支桿菌對PZA產生耐藥。pncA基因全長561 bp。其突變分布比較廣泛，可分布在啟動子區域和結構基因的各個位置。SCORPIO等[4]對9株PZA耐藥菌株進行SSCP分析，結果9株的SSCP 帶譜與藥物敏感菌株有差異，特異性100%。SREEVATSAN等[5]檢測了67株耐PZA分離株，72%有pncA基因突變。HOU等[6]應用 SSCP和DNA測序分析35株PZA耐藥菌株，32株有核苷酸的替代、插入和缺失，pncA突變率高達91.4%。國內吳雪瓊等[7]利用 PCRSSCP分析74株結核分支桿菌臨床分離株的pncA基因，32株PZA敏感株SSCP未發現異常，22株PZA耐藥株10株SSCP異常，pncA基因突變率為46%，進一步測序發現有58位和68位密碼子改變。李洪敏等[8]檢測了134例臨床耐5種藥物(PZA、鏈霉素、利福平、異煙肼、乙胺丁醇)分離株，對其中96株耐PZA分離株通過PCRSSCP技術進行分析，高耐藥株有35株出現泳動變位，低耐藥株有6株出現泳動變位，耐 PZA分離株總突變率為42.7%。王巍等[9]應用PCRSSCP方法分析117例老年結核病人，pncA基因突變率為41.0%。

　　本實驗結果表明，27株PZA pncA基因擴增陽性的耐藥分離株中，13株SSCP帶譜存在泳動異常,pncA基因突變率為48.1%(13/27)。比上述國內文獻結果略高，但顯著低于國外文獻結果。可見pncA基因的突變是本地區結核分支桿菌臨床分離株耐PZA的主要分子機制之一。據報道，72%～94%的PZA耐藥菌株中可見 pncA基因的丟失、插入或替代[1，6，10]。pncA基因突變的特點不一，是否與地理區域有關，尚需進一步探討。耐藥菌株中有14株SSCP帶譜與 H37Rv標準株相同，提示這14株耐藥菌株的耐藥性可能有其他的機制，如可能因為吡嗪酸在菌體內轉移，也可能由于pncA基因的突變不足以引起單鏈 DNA空間構象的改變[11，12]。PZA敏感菌株中有5株SSCP泳動異常，文獻[13，14]也有類似報道，可能為一些沉寂突變，還需進一步用 DNA測序來證明。

　　BACTEC培養系統藥敏結果與PCRSSCP分析結果在判斷結核分支桿菌耐藥性方面的差異無統計學意義，說明這兩種方法在檢測PZA耐藥性方面結果一致。由于PCRSSCP分析方法2 d內即可獲得測定結果，因此可用于快速檢測結核分支桿菌PZA藥敏試驗，彌補了常規藥敏試驗的不足。但此方法特異性不高，在臨床推廣應用有一定局限性。

　　總之，青島地區結核分支桿菌臨床分離株耐PZA的主要分子機制之一為pncA基因的突變。PCRSSCP技術可快速較準確地檢測結核分支桿菌耐PZA基因pncA的突變，彌補了常規藥敏試驗的不足。

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